Рефераты
Видео уроки
ВУЗы Украины
Мир
Рефератов
Рефератов
Отзывы о ВУЗах
Каталог одежды
Клиники Киева
|
Большая база бесплатных русских и украинских рефератов
Доклады, сочинения, контрольные работы, экзаменационные билеты и шпаргалки/шпоры Коллекция курсовых и дипломных работ для студентов |
Рефераты по Біологія
Біосенсори. Використання в медицині
Курсова робота
на тему: Біосенсори. Використання в медицині.
Виконав: Футерник Павло Володимирович,
студент ІІ-го курсу
ФПрН
Керівник : Куниця Наталья Іванівна, к.б.н.
Київ. 1999 р.
План.
Вступ. Розділ перший. Біологічний матеріал в біосенсорах.
І) Ферментні біосенсори.
ІІ) імуносенсори.
ІІІ) Біосенсори, що містять інтактні клітини.
ІV) Біосенсори базовані на молекулярних рецепторах.
V) Нуклеінові кислоти в біосенсорах.
Розділ другий. Перетворювачі різних типів, що використовуються в біосенсорах.
І) Електрохімічні біосенсори.
ІІ) Оптичні біосенсори.
ІІІ) Калориметричні біосенсори.
ІV) Мікрогравіметричні та акустичні біосенсори.
Розділ третій. Використання біосенсорів в клінічній діагностиці. Висновки.
Література.
Вступ.
Основною причиною різкого збільшення зацікавленості та досліджень в галузі біосенсорів в останні два десятки років є їх висока специфічність та чутливість, що досягається завдяки використанню біологічних молекул та систем. Біосенсор - це аналітичний прилад , що містить в своєму складі біологічний чутливий елемент (фермент, антитіло, ДНК, клітинні органели, клітини чи шматочки тканин) поєднаний з перетворювачем (електрохімічним, оптичним, калориметричним чи акустичним)(34). Вимірювання концентрації мішені аналізатор виконує кількісним перетворенням параметрів реакції у кількісний електричний чи оптичний сигнал (Малюнок 1).
Малюнок 1. Принцип роботи біосенсора.
Двома найбільш важливими властивостями будь якого біосенсору є : а) його специфічність та б) чутливість аналізатора відносно мішені. Специфічність біосенсора цілком керується властивостями біологічного компоненту, тому що саме тут речовина контактує з сенсором. Чутливість цілого приладу залежить як від біолгічного компоненту так і від перетворювача, тому що тут має бути чудова взаємодія між біомолекулою та аналізуємою речовиною, а також дуже висока ефективність наступного визначення реакції перетворювачем (Малюнок 2). В порівнянні з хімічними сенсорами набагато вигіднішими є біологічні сенсори, висока специфічність яких є результатом оптимального молекулярного розпізнавання.Це найкраще можна показати на прикладі взаємодії антиген-антитіло(Ат-Аг) , де антитіло може розпізнати та приєднати відповідний антиген з надзвичайно високою специфічністю.
Аналітичний рівень ( моль/л)
М ферментні електроди
mМ 10-3 прямі імуносенсори
mМ 10-6 непрямі імуносенсори
nМ 10-9
p М 10-12
fМ 10-15 імуноаналіз
aМ 10-18
Малюнок 2. Типовий ряд концентрацій, виміряний різними типами біосенсорів та імуноаналізом.
Найменші хімічні зміни в молекулярній структурі Аг можуть сильно зменшити спорідненість до Ат (яке мало перехідну реакційність). Наприклад, ферменти, як глюкозоксидаза, будуть розпізнавати свій природній субстрат (глюкозу в даному випадку) з набагато більшою спорідненістю, ніж інший компонент у реакційному середовищі. Хімічно подібні молекули (інші малі цукри) можуть проявляти деяку активність, якщо присутні в достатньо високій концентрації. Рівень специфічності , та в багатьох випадках чутливості, розпізнавання та вимірювання, що був досягнутий в біосенсорах, набагато перевищує той, що існує в переважній більшості хімічних сенсорів(2).
Висока специфічність біомолекул та біологічних систем, що стосується міжмолекулярних взаємодій, може бути використана в біосенсорних приладах лише при наявності високоефективного сполучення між біологічним компонентом та компонентом перетворювача. Ряд потенційних біологічних компонентів та подібний ряд перетворювачів можуть бути використані в біосенсорах (Таблиця 1), що робить дійсно необхідним мульті- та міждісциплінарний підхід у розробці та дослідженнях в цій області(36). Багато в області перетворювачів вже зроблено, але вона вимагає подальшого розвитку та оптимізації. На практиці широкий ряд оптичних та електрохімічних технологій було використано в поєднанні з біологічним аналізом.
Таблиця 1. Основні компоненти біосенсорів.
Біологічний компонент
Перетворювачі
Нуклеінові кислоти
Оптичні
Коферменти
Флуоресцентні
Антитіла
Поглинаючі
Рецептори
Електрохімчні
Ферменти
Амперометричні
Ферментні системи
Потенціометричні
Мембрани
Кондуктометричні
Органели
П’єзоелектричні
Клітини
Калориметричні
Тканини
Акустичні
Організми
Механічні
Біомолекули та біологічні системи, що застосовуються в біосенсорах, можуть бути розділени на наступні головні групи :
1) Ферменти
2) Антитіла
3) Клітини
4) Рецептори
5) Нуклеїнові кислоти
Інші перелічені класи біологічних компонентів , розглянутих в табл.1 (наприклад, органели, тканини, мембранні системи ), знаходять тільки обмежене застосування в галузі біосенсорів.
Розділ перший. Біологічний матеріал в біосенсорах.
1.Ферментні біосенсори.
Головну частину досліджень та розробок в області біосенсорів пов’язано з ферментами . Вони зручні для використання в біосенсорах як довготривалі визначники концентрації аналізуємих речовин. Серед широкого спектру ферментних біосенсорів основною рисою є перетворення ферментом аналізуємої речовини на певний продукт, який можна визначити . Цей продукт повинен мати певну електроактивність (наприклад, редокс-активність) чи оптичні якості (наприклад, флуоресценцію чи поглинання). Ферментні сенсори першого типу називаються ферментними електродами, другого типу - ферментними оптродами.
Відомі також три інші типи ферментних сенсорів, це : Ферментні термістори (де теплота ,що виділяється під час каталізованої ферментом реакції, вимірюється та пов’язується з концентрацією аналізуємої речовини); Інгібіторні ферментні сенсори(де аналізуєма речовина інгібує специфічну ферментну реакцію, змінюючи електрохімичний чи оптичний сигнал, з чого виходить ,що аналізуєма речовина не є субстратом ферменту); і, нарешті, новий тип ферментних оптродів, в яких сигнал виникає з самого ферменту або з асоційованої біомолекули (наприклад, коферменту), а не з продукту ферментної реакції. Таблиця 2 об’єднує основні типи ферментних сенсорів.
Певною метою в розробці ферментних біосенсорів є використання високої специфічністі та чутливості, що слугує прикладом фермент-субстратної взаємодії, як основи для визначальної та вимірювальної системи. Взаємодія між ферментом та його субстратом призводить до витрати субстрату та утворення продуктів. Це ефетивно використовується, коли перетворювач фіксує певну властивість продукту та генерує сигнал(36). Цей принцип ілюструє більшість ферментних біосенсорів.
Таблиця 2. Основні типи ферментних біосенсорів.
Перетворювач Принцип визначення Приклади
Аналіт Фермент
Електрохімічний а) Аналіт перетворюється Глюкоза Глюкозоксидаза
на електроактивний продукт
б) Аналіт інгібує ферментну CN- Цитохромоксидаза
реакцію яка продукує
електроактивну речовину
Оптичний а)Аналіт перетворюється на Холестерол Холестеролоксидаза
продукт з оптичними (О2)
влативостями(або індукуючий
оптичний сигнал.
б) Оптичні властивості Лактат Лактатмонооксигеназа
ферменту змінюються в
залежності від реакції з
аналітом.
в) Аналіт інгібує ферментну Пестициди Ацетилхолінестераза
реакцію, яка продукє речовину
з оптичними властивостями.
Калориметричний Реакція ферменту з аналітом Глюкоза Глюкозоксидаза
викликає виділення теплової
енергії.
ІІ. Імуносенсори.
Висока специфічність та висока чутливість, яка характеризує реакцію антиген- антитіло, були використані в різного роду лабораторних тестах, які використовували антитіла (імуноаналіз). Імуноаналіз - це багатоступінчатий лабораторний тест, який базується на розпізнаванні та зв’язуванні аналіта антитілом(36). На відміну від імуноаналізу, де можливе використання сигнал-генеруючих міток, калібровочних графіків та спеціальних операцій з середовищем (таких, як обробка зразка, оптимізація рН, певна послідовність дій, період витримування 5-30 хв. ), справжні імуносенсори ідеально характеризуються притаманною сигнал-генеративною властивістю, можливістю визначати антиген (аналіт) менше ніж за 2-3 хв. та деякою оберненістю.
Головною метою в розробці імуносенсорів є створення більш простих Ат-базованих тестів, які б поєднували чутливість та специфічність лабораторного імуноаналізу зі зручним обслуговуванням сенсорних приладів.Це дасть змогу проводити аналіз поза межами великих медичних установ. Лімітуючим фактором в створенні дешевих біосенсорів є те, що цілий прилад може бути використаний лише тільки раз. На практиці зараз впроваджуються імуносенсори, в яких використовуються замінні чіпи з біологічним матеріалом .
Молекули Аг мають великі розміри, і тому найчастіше в імунодіагностиці використовуються оптичні методи аналізу , ядерний магнітний резонанс (ЯМР) чи електрохімічні методи (рідше).
З електрохімічних найбільш поширеними в імуноаналізі є імуноферментні сенсори, в яких вимірюється не концентрація Аг, а тільки концентрація продуктів дії ферментів , які вивільняються при взаємодії Ат-Аг , і на базі результатів робляться висновки про концентрацію Аг.
Широко застосовуються непрямі потенціометричні методи тестування імунних реакцій. В цих методах тестування опосередковане або застосуванням ферментних міток, або використанням ліпосом з електроактивним вмістом,або застосуванням білків, кон’югованих з іонофорами(2).
Перелічені варіанти практично повністю охоплюють все різноманіття методів, де використовуються імуносенсори.
ІІІ. Біосенсори, що містять інтактні клітини.
Сенсори , які містять цілі клітини називаються цілоклітинними біосенсорами(36). Нижче перелічені властивості інтактних клітин, що можуть бути використані в біосенсорах:
а) Клітини чутливі до цілої низки речовин.
б) Ферменти, що містяться in situ мають оптимальну біологічну активність, на відміну
від ферментів in vitro.
в) Низька ціна препаратів (можливість росту в культурі).
Майже всі відомі цілоклітинні біосенсори містять прості бактеріальні чи водорослеві клітини; тваринні та рослинні клітини більш складні і набагато менш стійкі in vitro.
Відомо, що всі цілоклітинні біосенсори базуються на електрохімічних перетворювачах.За допомогою таких біосенсорів можна визначити амінокислоти (наприклад, аргінін), пестициди та інші інгібітори. Нещодавно стало відомо про біосенсор базований на оптичному перетворювачі в поєднанні з пігментованими клітинами(36).
Суттєвими недоліками клітинних біосенсорів є:
а)Швидка загибель клітин, що витрачають електрони, отримані в процесі життєдіяльності,
на ініціацію сигналу.
б)Втрата переносників сигналу - медіаторів через дифузію(2).
Нещодавно українськими вченими був розроблений кондуктометричний біосенсор, що базується на метилотрофних дріжджах Candida boidinii 706, за допомогою якого можна визначати етанол(40).
IV.Біосенсори, що містять молекулярні рецептори.
Біосенсорів цього типу відомо порівняльно мало, в основному, через проблему абсолютної ізоляції та стабілізації молекул в надзвичайному середовищі. Біосенсор такого типу може мати оптичний перетворювач і базуватися, наприклад, на ацетилхоліновому рецепторі нікотину або на електрохімічному перетворювачі і базуватися на зміні потенціалу мембрани, внаслідок обміну подібних речовин (наприклад, рибофлавіну та його аналогу (F), де чутливість сенсора може складати від 0.1 до 2Ч10-6 М рибофлавіну).
Подальший прогрес можливий в цій галузі біосенсорів лише за підримки молекулярної біології у підвищенні якості і стабільності рецепторів, що можна використовувати in vitro(2).
V. Нуклеінові кислоти в біосенсорах.
Біосенсори, які містять одноланцюгові молекули ДНК звичайно називають “ДНК-
-зондами” чи “ДНК-пробами”, вони використовуються при виявленні таких генетичних хвороб, як серповидна клітинна анемія, фенілкетонурія та ін.(Малюнок 3).
1. Схеметичне зображення біодатчика на основі одноланцюгових нуклеінових кислот.
ATGCCTAG
ковалентно закріплений на носії
фрагмент нуклеінової кислоти
Носій кислоти
Біодатчик
2. Дослідна проба, що містить одноланцюгові фрагменти нуклеїнової кислоти.
CTAAATCCGA
TACGGATC= радіоактивна мітка
ACTTG
3. Аналіз проби. ACTTG
TACGGATC=
ATGCCTAG
розпізнавання та утворення
комплементарного дуплекса CTAAATCCGA
Малюнок 3.Принципіальна схема біодатчика на основі одноланцюгової НК.
Значні успіхи досягнуті при виявленні патогенних мікроорганізмів за допомогою “ДНК-проб” в біологічних рідинах, харчових продуктах, оточуючому середовищі. В таблиці 3 наведені різні віруси,бактерії та інші патогенні мікроорганізми, які можна визначити за допомогою “ДНК-проб”(21).
Таблиця 3.
Віруси; Вірус гепатита В
Вірус гепатита А
Цитомегаловірус
Аденовіруси
Вірус герпеса
Ентеровіруси
Вірус папіломи людини
Ротавірус
Вірус HTLVI
Вірус HIV
Паповіруси
Риновіріси
Бактерії; Шигелла
Сальмонелла
Легіонелла
Кампілобактер
Золотистий стафілокок
Інші збудники; Трипаносома
Найпростіші з роду Plasmodium
Шистосома
Хламідія
Кандіда
Біосенсори на основі рідких кристалів суперспіральних молекул ДНК викликають особливу увагу через можливість існування кільцевих молекул ДНК у різних формах, що різняться за своїми властивостями, до того ж існування цих форм цілком залежить від зовнішніх факторів. Під дією ферментів (нуклеаз та рестриктаз) рощеплюється суперспіральна упаковка молекул і відбувається перебудова кристалів, що проявляється аномальною оптичною активністю дослідної дисперсії (Малюнок 4.). Цей біосенсор використовується для визначення агентів, що руйнують суперспіральну ДНК(41).
1.Формування дисперсної фази з суперспіральних молекул ДНК в полімер-вмісному
розчині
Суперспіральна ДНК Рідкокристалічна дисперсія
з суперспіральних молекул ДНК
Р Р Р
Р Р Р
Р Р Р
2.Розщеплення суперспіральних молекул ДНК ферментом призводить до утворення
холестеричних рідких кристалів
Р Р Р Р Р Р Р Р Р
Р Р Р Р Р Р Р Р Р
Р Р Р Р Р Р Р Р Р
Біодатчик Проміжна рідкокристалічна Холестерична дисперсна
фаза фаза із молекул ДНК
Малюнок 4. Принципіальна схема біодатчика на основі суперспіральної кільцевої ДНК в
полімервмісному розчині
Серед широкого різноманіття біосенсорів хочу ще окремо згадати світлочутливі біосенсори, як яскравий приклад використання біологічного матеріалу.Світлочутливі біосенсори-це прилади, що містять в якості робочого матеріалу ті чи інші фоточутливі біологічні структури (макромолекули, фоторецепторні мембрани) і призначені для реєстрації, перетворювання та зберігання оптичної інформації.
Відправним пунктом та стимулом до розробки та створення таких сенсорів слугують дані про високу квантову ефективність, чутливість та широкий динамічний діапазон природніх світлочутливих систем, що беруть участь в таких процесах, як зір, фотосинтез та ін.
Важливу роль в створенні молекулярних приладів відіграють біомолекули, а саме, природні хромофор-білкові комплекси, що містяться в фоторецепторних та енергоперетворюючих мембранах.
Наявність у цих комплексів цілого ряда унікальних властивостей: фотохромізма, електрохромізма, електрогенного характеру функціональних реакцій, природньої поляризації компонентів та ін. - дозволяє намітити шляхи для використання препаратів зазначених комплексів для цілей біотехнології, біоелектроніки та при розробці приладів корисного використання сонячної енергії, сенсорних елементів систем перетворення та реєстрації інформації(42).
Розділ другий.Перетворювачі різних типів, що використовуються в біосенсорах.
І.Електрохімічні біосенсори.
Електрохімічні біосенсори являють собою електрохімічні перетворювачі в поєднанні з ферментами (але не завжди). Ферментні електроди були найпершими описані в літературі та розроблені на комерційному доступному рівні(10).
Ферментні реакції можна вимірювати використовуючи амперометричні, потенціометричні та кондуктометричні біосенсори. Амперометричні біосенсори вимірюють електричний струм, коли напруга виникає між робочим електродом та електродом порівняння. З хімічного боку також впливають окисно-відновні реакції, що викликають струм. Найбільш поширенним прикладом такого роду аналізу є визначення глюкози з використанням глюкозоксидази:
Глюкоза + Кисень ——Глюконолактон + Перекис водню
Зміну концентрації кисню можна визначити за допомогою кисневого електроду Кларка, на якому кисень проникає крізь напівпроникну мембрану, щоб відновитися на платиновому електроді. Навпаки, зміна концентрації перекису водню спостерігається при окисленні на платиновому електроді. Обидва ці підходи мають фундаментальні недоліки. Атмосферний кисень може вносити похибки, до того ж важливим є не допустити впливу інших електроактивних компонентів.
Щоб уникнути похибок, в ферментних реакціях, використовують альтернативні джерела електронів. Ці акцептори електронів відомі як медіатори, що переносять електрони між реагентами та електродом(5). Прикладом такого медіатору слугує залізо(Fe/Fe3+):
Глюкоза + 2Fe+ ——— Глюконолактон + 2Fe + 2H+ Залізо окислюється на аноді, щоб відновитися в реакції. Сенсор не є чутливим до кисню. Найвища межа лінійного ряду може бути підвищена використанням мембрани, яка б лімітувала рівень дифузії глюкози до електрода так, що б кінетика зворотньої реакції не залежала від константи спорідненості (Km) ферменту. Принцип медіаторного амперометричного біосенсору було використано для ряду аналізів, вимірюючих спирт(1), СО(35), D–галактозу, гліколат та L–амінокислоти(14). Також є дані про використання амперометричного методу для імуноаналізу з використанням ферментного підсилення. Цей імуноаналіз побудований по типу “сендвіча”, де друге антитіло приєднано до лужної фосфатази. Лужна фосфатаза претворює NADP на NAD. NAD включається до відновлювального циклу, вмикаючи дегідрогеназу та діафоразу. Відновлювальний цикл відновлює медіатор ферріцианід, який визначається амперометрично(6).
Оксидоредуктази часто вимогають нікотинаміднуклеотиди в якості кофакторів. Ці дорогі, нестабільні, розчинні компоненти роблять структуру простих, надійних біосенсорів непрактичною.
Потенціометричний ферментний електрод характеризується тим, що різниця потенціалів формується на чутливому елементі і вона вимірюється дуже чутливим приладом, до того ж не виникає току крізь мембрану і тому рівень дифузії не є важливим. Потенціометричні сенсори, що використовуються в біосенсорах, включають іоноселективні електроди, газочутливі електроди та польові транзистори. Іоноселективні та газочутливі електроди вже широко застосовуються в клінічному аналізі(11) і знайшли місце в біосенсорах. Водневий іоноселективний електрод (рН-електрод) був використаний для аналізу пеніциліну, з використанням ферменту беталактамази, яка перетворює пеніцилін на пеніцилову кислоту. Електрод рН визначає концентрацію кислоти(25). Амонійний іоноселективний електрод було використано в поєднанні з імобілізованою уреазною мембраною для визначення сечовини в крові(39). G. Guilbault та F.R.Shu(17)використали СО2 чутливий електрод для розпізнавання іншого продукту уреазної реакції. Також відомі йодид та фторид іоноселективні елекроди як компоненти біосенсорів.
Цікавий потенціометричний імуноаналіз був описаний для антитіл до дигоксину(18). Іонофор був хімічно пов’язаний з дигоксином. Цей кон’югат був приєднували до мембрани, яка була вмонтована на чутливий кінчик звичайного потенціометричного електроду (Малюнок 5). Коли отриманий електрод вміщували до середовища, що містило іони, здатні проникати крізь мембрану, спостерігалася зміна потенцалу. До того ж, коли антитіло до дигоксину було присутнім в поєднанні з дигоксином, це призводило до зміни здатності іонофору транспортувати маркерний іон. Ця зміна потенціалу виміряна пропорційно до концентрації присутнього антитіла.
електрод затвору
ПХВ- ллівка джерело затворний виток в, що проявляється аномальною оптичною активністю дослідної дисперсії (Малюнок 4.). Цей біосенсор використовується для визначення агентів, що руйнують суперспіральну ДНК(41).
1.Формування дисперсної фази з суперспіральних молекул ДНК в полімер-вмісному
розчині
Суперспіральна ДНК Рідкокристалічна дисперсія
з суперспіральних молекул ДНК
Р Р Р
Р Р Р
Р Р Р
2.Розщеплення суперспіральних молекул ДНК ферментом призводить до утворення
холестеричних рідких кристалів
Р Р Р Р Р Р Р Р Р
Р Р Р Р Р Р Р Р Р
Р Р Р Р Р Р Р Р Р
Біодатчик Проміжна рідкокристалічна Холестерична дисперсна
фаза фаза із молекул ДНК
Малюнок 4. Принципіальна схема біодатчика на основі суперспіральної кільцевої ДНК в
полімервмісному розчині
Серед широкого різноманіття біосенсорів хочу ще окремо згадати світлочутливі біосенсори, як яскравий приклад використання біологічного матеріалу.Світлочутливі біосенсори-це прилади, що містять в якості робочого матеріалу ті чи інші фоточутливі біологічні структури (макромолекули, фоторецепторні мембрани) і призначені для реєстрації, перетворювання та зберігання оптичної інформації.
Відправним пунктом та стимулом до розробки та створення таких сенсорів слугують дані про високу квантову ефективність, чутливість та широкий динамічний діапазон природніх світлочутливих систем, що беруть участь в таких процесах, як зір, фотосинтез та ін.
Важливу роль в створенні молекулярних приладів відіграють біомолекули, а саме, природні хромофор-білкові комплекси, що містяться в фоторецепторних та енергоперетворюючих мембранах.
Наявність у цих комплексів цілого ряда унікальних властивостей: фотохромізма, електрохромізма, електрогенного характеру функціональних реакцій, природньої поляризації компонентів та ін. - дозволяє намітити шляхи для використання препаратів зазначених комплексів для цілей біотехнології, біоелектроніки та при розробці приладів корисного використання сонячної енергії, сенсорних елементів систем перетворення та реєстрації інформації(42).
Розділ другий.Перетворювачі різних типів, що використовуються в біосенсорах.
І.Електрохімічні біосенсори.
Електрохімічні біосенсори являють собою електрохімічні перетворювачі в поєднанні з ферментами (але не завжди). Ферментні електроди були найпершими описані в літературі та розроблені на комерційному доступному рівні(10).
Ферментні реакції можна вимірювати використовуючи амперометричні, потенціометричні та кондуктометричні біосенсори. Амперометричні біосенсори вимірюють електричний струм, коли напруга виникає між робочим електродом та електродом порівняння. З хімічного боку також впливають окисно-відновні реакції, що викликають струм. Найбільш поширенним прикладом такого роду аналізу є визначення глюкози з використанням глюкозоксидази:
Глюкоза + Кисень ——Глюконолактон + Перекис водню
Зміну концентрації кисню можна визначити за допомогою кисневого електроду Кларка, на якому кисень проникає крізь напівпроникну мембрану, щоб відновитися на платиновому електроді. Навпаки, зміна концентрації перекису водню спостерігається при окисленні на платиновому електроді. Обидва ці підходи мають фундаментальні недоліки. Атмосферний кисень може вносити похибки, до того ж важливим є не допустити впливу інших електроактивних компонентів.
Щоб уникнути похибок, в ферментних реакціях, використовують альтернативні джерела електронів. Ці акцептори електронів відомі як медіатори, що переносять електрони між реагентами та електродом(5). Прикладом такого медіатору слугує залізо(Fe/Fe3+):
Глюкоза + 2Fe+ ——— Глюконолактон + 2Fe + 2H+ Залізо окислюється на аноді, щоб відновитися в реакції. Сенсор не є чутливим до кисню. Найвища межа лінійного ряду може бути підвищена використанням мембрани, яка б лімітувала рівень дифузії глюкози до електрода так, що б кінетика зворотньої реакції не залежала від константи спорідненості (Km) ферменту. Принцип медіаторного амперометричного біосенсору було використано для ряду аналізів, вимірюючих спирт(1), СО(35), D–галактозу, гліколат та L–амінокислоти(14). Також є дані про використання амперометричного методу для імуноаналізу з використанням ферментного підсилення. Цей імуноаналіз побудований по типу “сендвіча”, де друге антитіло приєднано до лужної фосфатази. Лужна фосфатаза претворює NADP на NAD. NAD включається до відновлювального циклу, вмикаючи дегідрогеназу та діафоразу. Відновлювальний цикл відновлює медіатор ферріцианід, який визначається амперометрично(6).
Оксидоредуктази часто вимогають нікотинаміднуклеотиди в якості кофакторів. Ці дорогі, нестабільні, розчинні компоненти роблять структуру простих, надійних біосенсорів непрактичною.
Потенціометричний ферментний електрод характеризується тим, що різниця потенціалів формується на чутливому елементі і вона вимірюється дуже чутливим приладом, до того ж не виникає току крізь мембрану і тому рівень дифузії не є важливим. Потенціометричні сенсори, що використовуються в біосенсорах, включають іоноселективні електроди, газочутливі електроди та польові транзистори. Іоноселективні та газочутливі електроди вже широко застосовуються в клінічному аналізі(11) і знайшли місце в біосенсорах. Водневий іоноселективний електрод (рН-електрод) був використаний для аналізу пеніциліну, з використанням ферменту беталактамази, яка перетворює пеніцилін на пеніцилову кислоту. Електрод рН визначає концентрацію кислоти(25). Амонійний іоноселективний електрод було використано в поєднанні з імобілізованою уреазною мембраною для визначення сечовини в крові(39). G. Guilbault та F.R.Shu(17)використали СО2 чутливий електрод для розпізнавання іншого продукту уреазної реакції. Також відомі йодид та фторид іоноселективні елекроди як компоненти біосенсорів.
Цікавий потенціометричний імуноаналіз був описаний для антитіл до дигоксину(18). Іонофор був хімічно пов’язаний з дигоксином. Цей кон’югат був приєднували до мембрани, яка була вмонтована на чутливий кінчик звичайного потенціометричного електроду (Малюнок 5). Коли отриманий електрод вміщували до середовища, що містило іони, здатні проникати крізь мембрану, спостерігалася зміна потенцалу. До того ж, коли антитіло до дигоксину було присутнім в поєднанні з дигоксином, це призводило до зміни здатності іонофору транспортувати маркерний іон. Ця зміна потенціалу виміряна пропорційно до концентрації присутнього антитіла.
електрод затвору
ПХВ- ллівка джерело затворний виток
оксид
- дигоксин-іонофор кон’югат
- дигоксинові антитіла
| 1 | 2 | 3 | след. → |
